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具體時(shí)間需要摸索,而濃度一般有工作液,若是濃縮液還要摸索濃度,切記要避光反應(yīng)。但在免疫熒光中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間先定下,然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間。***,熒光素標(biāo)記的二抗隨著保存時(shí)間的延長,可能后有大量的游離熒光素殘留,需要注意配制時(shí)小包裝和并進(jìn)行適當(dāng)?shù)碾x心。6)復(fù)染目的是形成細(xì)胞輪廓,從而更好對目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位。一般常用DAPI復(fù)染。7)封片為了長期保存,我們一般用緩沖甘油等封片,此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產(chǎn)生氣泡,方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液,然后一手拿住蓋片某一拐角,而另一手拿對面的那個(gè)拐角,接近封片液近端的拐角先降低,直至接觸到液體時(shí)為止;當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時(shí),則可以緩慢降低另一拐角,這樣一般不會產(chǎn)生氣泡。8)切片清洗為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色,所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗(延長時(shí)間和增多次數(shù))尤為重要,我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次,江蘇四色免疫組化檢測服務(wù),而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。注意:⑴單獨(dú)沖洗,防止交叉反應(yīng)造成污染,江蘇四色免疫組化檢測服務(wù)。⑵溫柔沖洗,防止切片的脫落,江蘇四色免疫組化檢測服務(wù)。我喜歡用浸洗方式;⑶沖洗的時(shí)間要足夠,才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。⑷PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。江蘇四色免疫組化檢測服務(wù)
使用的玻片等載體,都必須厚度均勻,無明顯的自發(fā)熒光,如果使用油鏡,還必須保證鏡油為無熒光鏡油;電源比較好裝穩(wěn)壓器,否則電壓不穩(wěn)不僅會降低汞燈的壽命,也會影響鏡檢的效果。3、免疫組化和免疫熒光結(jié)果分析:見***場試驗(yàn)講座。案例一DAB染色后切片著色一片黃/背景深背景:奧運(yùn)會期間我們課題組研究生都在實(shí)驗(yàn)室做實(shí)驗(yàn),許多從北京購買的試劑買不到,對我們的許多實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了很大的影響。我以前一直用中杉金橋的SP三步法染色試劑盒,效果不錯(cuò),在奧運(yùn)會期間我準(zhǔn)備做同批實(shí)驗(yàn)分不同批次酶免疫組化實(shí)驗(yàn),***批組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果很好,抗體濃度感覺比較合適(SantaCruz公司1:200),等做第二批時(shí)發(fā)現(xiàn)封閉血清不夠了,為了保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行,我又從福州邁新頂了一個(gè)SP試劑盒,同時(shí)抗體稀釋液也不夠了,我又重新從博士德公司買了一小瓶10ml。從第二批實(shí)驗(yàn)開始,組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果一直顯示強(qiáng)背景著色,特異性染色很難辨別。后來我將標(biāo)本拿到上海舜田生物去做,做了效果很不錯(cuò),于是我就請教了他們公司從事病理30多年經(jīng)驗(yàn)的老師,她告訴我應(yīng)該如何去分析和解決問題,很快我就找到了思路,結(jié)果問題終于解決了。天津六色免疫組化染色服務(wù)
因而它是大多數(shù)免疫組化中優(yōu)先的組織標(biāo)本制作方法。1、取材的特殊要求及注意事項(xiàng)·標(biāo)本新鮮:一般在2h以內(nèi)進(jìn)行,超過2h,組織將有不同程度的自溶,其抗原或變性消失,或嚴(yán)重彌散?!と〔牟课唬撼〔≡罨蚝龣z抗原部位外,還應(yīng)取病灶與正常交界處,即所取組織切片中同時(shí)應(yīng)有抗原陽性和陰性區(qū),以形成自身對照。–細(xì)胞壞死后,不僅抗原彌散或消失,而且常引起非特異著色,干擾觀察,因此取材時(shí)應(yīng)盡可能避開壞死區(qū)。1、取材的特殊要求及注意事項(xiàng)(續(xù))·避免擠壓:取材時(shí)組織受擠壓可使邊緣部細(xì)胞形態(tài)改變并加深非特異著色,因而取材時(shí)應(yīng)使用鋒利的刀刃;–鑷取組織動作要輕;–經(jīng)窺鏡直接鉗取的組織往往有過度擠壓,觀察結(jié)果時(shí)應(yīng)有所考慮。2、固定及常用的固定液·取材后的組織需立刻投于固定劑中–固定使組織和細(xì)胞的蛋白質(zhì)凝固,終止內(nèi)源性或外源性酶反應(yīng),防止組織自溶或異溶,以保持原有結(jié)構(gòu)和形態(tài);–對免疫組化而言更有原位保存抗原的作用,避免抗原失活或彌散?!こS霉潭ㄒ海汗潭▌┢贩N很多,但大多屬于醛類和醇類。其固定原理不同,各有優(yōu)缺點(diǎn)。–醛類(常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛)–醇類(常用乙醇)–其它(**)(1)醛類·甲醛。
【多色免疫組化染色樣本要求】1福爾馬林固定的蠟塊或玻片,大塊組織或TMA都可以,封蠟不能有明顯的破損。2玻片樣本,組織需要緊貼玻片,避免褶皺,玻片不能有破損、劃傷或污漬。3組織**小應(yīng)包含大于1000個(gè)細(xì)胞。4蠟塊需包埋實(shí)體瘤組織,壞死瘤組織、細(xì)針穿刺物、細(xì)胞甩片樣品會影響染色效果。5組織應(yīng)當(dāng)用10%中性福爾馬林固定,正常固定時(shí)間為18~24小時(shí)。6切片厚度為4μm左右,使用防脫玻片。建議玻片在固定后一周內(nèi)制備為佳。7不要在水浴撈片環(huán)節(jié)添加任何粘合劑,樣本應(yīng)置于玻片正面、**。將撈片豎直置于吸水紙上去除水分,輕敲去除水滴,不要用紙擦拭玻片。8玻片置于45°C熱盤上放置30min(自然風(fēng)干玻片時(shí)長不小于1小時(shí))。【設(shè)備耗材】1檢驗(yàn)所需設(shè)備器材:熒光顯微鏡、通風(fēng)櫥、移液器、恒溫干燥箱、微波爐、計(jì)時(shí)器2檢測所需耗材器皿:免疫組化筆、微波修復(fù)杯、染色缸、孵育濕盒、蓋玻片、洗瓶、量筒100ml、量筒1000ml等【試劑制備】1通用試劑:DMSO、miejun去離子水、二甲苯、乙醇(全部、95%、70%)、10%中性福爾馬林、抗原修復(fù)液(推薦使用佰諾全景酸性或堿性抗原修復(fù)液)、一抗封閉液等。
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江蘇四色免疫組化檢測服務(wù)
問題及其解答:產(chǎn)生組織切片非特異性染色的原因有哪些?如何解決?1、抗體孵育時(shí)間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來控制。這是**重要的一條。2、一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色,建議試用單克隆抗體看看。3、內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高(含血細(xì)胞多的組織),需要通過延長滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來降低背景染色;4、非特異性組分與抗體結(jié)合,這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果;5、DAB孵育時(shí)間過長或濃度過高;6、PBS沖洗不充分,殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色,在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤為重要;7、標(biāo)本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片,這容易增強(qiáng)非特異性著色。我的實(shí)際解決方案:以上的分析可能對于初學(xué)者還是不容易的,下面我就把我的排除實(shí)驗(yàn)的具體過程與大家進(jìn)行分享、交流和討論。1、首先排除抗體孵育條件。一般來說,著色效果的好壞與抗體的孵育條件是密不可分的,由于用SP法已經(jīng)做出來過一次且效果不錯(cuò),因此對于同樣組織的同一抗原進(jìn)行分析,這種因素可以先排除。2、其次,DAB孵育時(shí)間是否太長?做出來那一次我是孵育8min,后來也是8-10min。江蘇四色免疫組化檢測服務(wù)
上海朝瑞生物科技有限公司坐落在上海市松江區(qū)廣富林路697號昂立大廈2113室,是一家專業(yè)的1.發(fā)布科研技術(shù) 2.發(fā)布應(yīng)用技術(shù) 3.發(fā)布專業(yè)專長 4.發(fā)布科研成果 5.發(fā)布我的需求 6.發(fā)布篩選檢驗(yàn)檢測服務(wù) 7.發(fā)布協(xié)同代研發(fā)服務(wù) 8.發(fā)布升級改造產(chǎn)品服務(wù) 9.發(fā)布實(shí)驗(yàn)室及儀器設(shè)備共享 10.發(fā)布培訓(xùn)基地共享 11.發(fā)布工廠代加工及共享車間 12.發(fā)布科研/項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)招聘13.發(fā)布研究生婚戀 14.發(fā)布項(xiàng)目整包服務(wù) 15.發(fā)布資源交換業(yè)務(wù)公司。目前我公司在職員工達(dá)到5~10人人,是一個(gè)有活力有能力有創(chuàng)新精神的高效團(tuán)隊(duì)。公司以誠信為本,業(yè)務(wù)領(lǐng)域涵蓋[ "科研技術(shù)服務(wù)", "應(yīng)用技術(shù)服務(wù)", "科研成果轉(zhuǎn)化", "科學(xué)產(chǎn)品銷售" ],我們本著對客戶負(fù)責(zé),對員工負(fù)責(zé),更是對公司發(fā)展負(fù)責(zé)的態(tài)度,爭取做到讓每位客戶滿意。公司憑著雄厚的技術(shù)力量、飽滿的工作態(tài)度、扎實(shí)的工作作風(fēng)、良好的職業(yè)道德,樹立了優(yōu)良的[ "科研技術(shù)服務(wù)", "應(yīng)用技術(shù)服務(wù)", "科研成果轉(zhuǎn)化", "科學(xué)產(chǎn)品銷售" ]形象,贏得了社會各界的信任和認(rèn)可。
文章來源地址: http://m.cdcfah.com/cp/248115.html
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