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蛋白質(zhì)分離純化步驟(二) 2.4.3. 親和層析 親和層析(affinity-chromatography)分離技術(shù)是根據(jù)許多蛋白質(zhì)對(duì)特定的化學(xué)基團(tuán)具有專(zhuān)一性結(jié)合的原理。這些能被生物大分子如蛋白質(zhì)所識(shí)別并與之結(jié)合的基團(tuán)稱(chēng)為配基或配體(ligand)。親和層析是一種極有效的分離純化蛋白質(zhì)的方法。例如酶對(duì)它的底物具有特殊的親和力;抗原和抗體互為配基。以伴刀豆球蛋白A(concanavalin A)的分離純化為例,由于該蛋白對(duì)葡萄糖有專(zhuān)一性親和吸附,因此可把葡萄糖通過(guò)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價(jià)地連接到像瓊脂糖凝膠一類(lèi)的載體表面上。為了防止載體表面的空間位阻影響待分離的蛋白質(zhì)大分子與其配基的結(jié)合,在配基和載體之間往往插入一段所謂的連接臂(或稱(chēng)為間隔臂,spacerarm),樣品前處理專(zhuān)業(yè)蛋白純化系統(tǒng)上門(mén)維修,使配體與載體之間保持足夠的距離。 將這種多糖顆粒裝入一定規(guī)格的玻璃管中就制成了一根親和層析柱,樣品前處理專(zhuān)業(yè)蛋白純化系統(tǒng)上門(mén)維修。當(dāng)含有伴刀豆球蛋白的提取液加到層析柱的上部,樣品前處理專(zhuān)業(yè)蛋白純化系統(tǒng)上門(mén)維修,并沿柱從上往下過(guò)時(shí),待純化的蛋白質(zhì)與其特異性配基結(jié)合而被吸附到柱上,其他蛋白因不能與葡萄糖配基結(jié)合將通過(guò)柱子而流出(圖2-28a)。然后采用一定的洗脫條件,如濃的葡萄糖溶液進(jìn)行洗脫,即可把該蛋白質(zhì)洗脫下來(lái),達(dá)到與其它蛋白質(zhì)分離的目的。樣品前處理專(zhuān)業(yè)蛋白純化系統(tǒng)上門(mén)維修
三、蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定 蛋白質(zhì)分子量測(cè)定的方法很多,目前常用的方法有以下幾種。 3.1 凝膠過(guò)濾法 凝膠過(guò)濾法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理如“分離純化方法”中所 述。一定型號(hào)的凝膠顆粒上具有一定大小的孔隙,只允許較小的分子進(jìn)入膠粒,而大于孔隙的分子則不能進(jìn)入膠粒而被排阻在膠粒外面。用洗脫液洗脫時(shí),被排阻的分子量大的蛋白質(zhì)先被洗脫下來(lái),隨后能夠進(jìn)入顆粒的蛋白質(zhì)也按分子量大小而先后被洗脫下來(lái),分子量越小的越后被洗脫下來(lái)。由于不同排阻范圍的葡聚糖凝膠有一特定的蛋白質(zhì)分子量范圍,在此范圍內(nèi),分子量的對(duì)數(shù)和洗脫體積之間成線性關(guān)系。因此,用幾種已知分子量的蛋白質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行層析分析,以每種蛋白質(zhì)的洗脫體積對(duì)它們的分子量的對(duì)數(shù)作圖,繪制出標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線。未知蛋白質(zhì)在同樣的條件下進(jìn)行層析分析,根據(jù)其所用的洗脫體積,從標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線上可求出此未知蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的分子量來(lái)。山東智能蛋白純化系統(tǒng)廠家報(bào)價(jià)
蛋白質(zhì)純化方法-親和層析親和層析法包括特異性配體親和層析法以及通用性配體親和層析法。比較這兩種親和層析法。特異性配體親和層析法通常將復(fù)雜的生命大分子物質(zhì)作為配體,它的結(jié)合力比較大河吸附選擇性比較強(qiáng)。而通用性配體親和層析法通常將簡(jiǎn)單的小分子物質(zhì)作為配體,因此,它具有低廉的成本,吸附容量比較高,通過(guò)對(duì)吸附和脫附條件的改善能夠使得層析的分辨率提高。原理親和層析的原理類(lèi)似于酶-底物,***-受體與抗原-抗體等特異性反應(yīng)的機(jī)理。有一定的親和力在每對(duì)反應(yīng)物之間。與在酶與底物的反應(yīng)中,只有特異的底物才可以結(jié)合一定的酶,使復(fù)合物產(chǎn)生相同。在親和層析中,只有特異的配體才可以和一定的生命大分子有親和力,并且使復(fù)合物產(chǎn)生。親和層析配體呈固相,而酶與底物的反應(yīng)底物呈液相是它們的不同點(diǎn)。事實(shí)上,親和層析是在含有活化基團(tuán)的基質(zhì)M上以共價(jià)鍵的方式固化具有識(shí)別能力的配體L,將固相載體制作成功而固化后的配體束縛特異物質(zhì)的能力依然保持。所以當(dāng)在小層析柱裝入固相載體,使得欲分離的樣品在該柱經(jīng)過(guò)。此時(shí),樣品中對(duì)配體有親和力的物質(zhì)S就能夠通過(guò)結(jié)構(gòu)互補(bǔ)效應(yīng)、范德瓦爾力與靜電引力等作用在固相載體上吸附著。
三、蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定 3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定分子量 蛋白質(zhì)在普通聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度取決于蛋白質(zhì)分子大小、所帶電荷的量以及分子形狀。而SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳與此不同的是在樣品及電泳緩沖液中加入了十二烷基***鈉(sodium dodecylsulfate,SDS)。SDS是一種陰離子去污劑,可使蛋白質(zhì)變性并解離成亞基。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品中加入SDS(一般加入量為0.1%)后,SDS與蛋白質(zhì)分子結(jié)合,使蛋白質(zhì)分子帶上大量的負(fù)電荷,這些電荷量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)蛋白質(zhì)分子原來(lái)所帶的電荷量,因而掩蓋了不同蛋白質(zhì)之間的電荷差異。所有結(jié)合SDS的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的形狀近似于長(zhǎng)的橢園棒,它們的短軸是恒定的,而長(zhǎng)軸與蛋白質(zhì)分子量的大小成正比。這樣,消除了蛋白質(zhì)之間原有的電荷和形狀的差異,電泳的速度只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。 進(jìn)行凝膠電泳時(shí),常常用一種染料作前沿物質(zhì),蛋白質(zhì)分子在電泳中的移動(dòng)距離和前沿物質(zhì)移動(dòng)的距離之比值稱(chēng)為相對(duì)遷移率,相對(duì)遷移率和分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)成直線關(guān)系。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)和其相對(duì)遷移率作圖,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。將未知蛋白質(zhì)在同樣條件下電泳,根據(jù)測(cè)得的樣品相對(duì)遷移率,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上便可查出其分子量。
蛋白質(zhì)分離純化步驟(二) 分離純化蛋白質(zhì)的一般程序 2.1 材料的預(yù)處理及細(xì)胞破碎 分離提純某一種蛋白質(zhì)時(shí),首先要把蛋白質(zhì)從組織或細(xì)胞中釋放出來(lái)并保持原來(lái)的天然狀態(tài),不喪失活性。所以要采用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎。常用的破碎組織細(xì)胞的方法有: 1. 機(jī)械破碎法 這種方法是利用機(jī)械力的剪切作用,使細(xì)胞破碎。常用設(shè)備有,高速組織搗碎機(jī)、勻漿器、研缽等。 2. 滲透破碎法 這種方法是在低滲條件使細(xì)胞溶脹而破碎。 3. 反復(fù)凍融法 生物組織經(jīng)凍結(jié)后,細(xì)胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹而使細(xì)胞脹破。這種方法簡(jiǎn)單方便,但要注意那些對(duì)溫度變化敏感的蛋白質(zhì)不宜采用此法。 4. 超聲波法 使用超聲波震蕩器使細(xì)胞膜上所受張力不均而使細(xì)胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破壞微生物細(xì)胞等。山東智能蛋白純化系統(tǒng)廠家報(bào)價(jià)
樣品前處理專(zhuān)業(yè)蛋白純化系統(tǒng)上門(mén)維修
儀器儀表行業(yè)已經(jīng)連續(xù)多年保持了經(jīng)濟(jì)高位運(yùn)行的態(tài)勢(shì)。即使當(dāng)全球受金融風(fēng)暴的影響,各個(gè)行業(yè)經(jīng)濟(jì)東圃有所放緩,但從全景發(fā)展情況看來(lái),儀表行業(yè)的增長(zhǎng)速度并沒(méi)有放緩。隨著網(wǎng)絡(luò)消費(fèi)的不斷遞增,而互聯(lián)網(wǎng)的的商業(yè)價(jià)值不斷被挖掘出來(lái),呈爆發(fā)式增長(zhǎng),傳統(tǒng)的營(yíng)銷(xiāo)模式將逐步被取代。其他內(nèi)資企業(yè)企業(yè)要抓住機(jī)遇,融入到互聯(lián)網(wǎng)發(fā)展的行業(yè)中,為行業(yè)的發(fā)展提高競(jìng)爭(zhēng)力。工業(yè)領(lǐng)域轉(zhuǎn)型升級(jí)、提升發(fā)展質(zhì)量等有利于儀器儀表行業(yè)的發(fā)展;**安全、社會(huì)安全、產(chǎn)業(yè)和信息安全等需要自主、蛋白純化色譜系統(tǒng),凝膠凈化色譜系統(tǒng),制備液相色譜,柱塞泵裝備,成為全社會(huì)共識(shí);隨著中國(guó)的不斷進(jìn)步,世界上只有一個(gè)救世主——市場(chǎng),能救企業(yè)的只有你自己——自強(qiáng),提高生產(chǎn)型重點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)力才是中國(guó)制造業(yè)的獨(dú)一出路。以顯微科學(xué)儀器行業(yè)的發(fā)展與變化為例,以親身的實(shí)踐為例,毛磊認(rèn)為,隨著經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展,我國(guó)的環(huán)境和實(shí)力都發(fā)生了巨大變化,有了完全不同的基礎(chǔ),這為國(guó)產(chǎn)科學(xué)儀器走向**增強(qiáng)了信心。樣品前處理專(zhuān)業(yè)蛋白純化系統(tǒng)上門(mén)維修
蘇州英賽斯智能科技有限公司致力于儀器儀表,是一家生產(chǎn)型公司。公司自成立以來(lái),以質(zhì)量為發(fā)展,讓匠心彌散在每個(gè)細(xì)節(jié),公司旗下蛋白純化色譜系統(tǒng),凝膠凈化色譜系統(tǒng),制備液相色譜,柱塞泵深受客戶(hù)的喜愛(ài)。公司從事儀器儀表多年,有著創(chuàng)新的設(shè)計(jì)、強(qiáng)大的技術(shù),還有一批**的專(zhuān)業(yè)化的隊(duì)伍,確保為客戶(hù)提供良好的產(chǎn)品及服務(wù)。英賽斯立足于全國(guó)市場(chǎng),依托強(qiáng)大的研發(fā)實(shí)力,融合前沿的技術(shù)理念,飛快響應(yīng)客戶(hù)的變化需求。
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