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產(chǎn)品關(guān)鍵詞:北京長條帶Western Blot技術(shù)服務(wù)
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詳細(xì)說明
轉(zhuǎn)膜完畢后,立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液(P0023C)中,漂洗1-2分鐘,以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液,北京長條帶Western Blot技術(shù)服務(wù)。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟,一定要注意膜的保濕,避免膜的干燥,否則極易產(chǎn)生較高的背景。用微型臺(tái)式真空泵或滴管等吸盡封閉液,立即加入稀釋好的一抗,室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。如果一抗孵育一小時(shí)效果不佳,可以4℃緩慢搖動(dòng)孵育過夜。或更據(jù)抗體的說明選擇適當(dāng)?shù)姆跤郎囟群蜁r(shí)間。微型臺(tái)式真空泵或滴管等吸盡洗滌液,立即加入稀釋好的二抗,室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。 回收二抗。加入Western洗滌液,在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后,再加入洗滌液洗滌5-10分鐘,北京長條帶Western Blot技術(shù)服務(wù)。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。使用
ECL化學(xué)發(fā)光試劑來檢測蛋白。壓片可以采用**的壓片暗盒進(jìn)行。洗片時(shí)可以使用X光片自動(dòng)洗片機(jī)。如果沒有自動(dòng)洗片機(jī),北京長條帶Western Blot技術(shù)服務(wù),可以用顯影定影試劑盒自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片。X光片推薦選用柯達(dá)原裝的生物實(shí)驗(yàn)**柯達(dá)X-OMAT BT膠片。
全自動(dòng)western blot無需凝膠、無需轉(zhuǎn)印,放入您的樣品,按個(gè)按鈕,然后就沒事了。首先,將樣品與Simple
Western樣品緩沖液混合,至終濃度1 μg/μL,還原并變性,然后將制備好的樣品、一抗和二抗、化學(xué)發(fā)光底物分配到384孔分析板的指定孔中。之后,將Simple
Western分析緩沖液、毛細(xì)管和制備好的分析板放入Simon內(nèi),它自動(dòng)開展所有分析步驟。當(dāng)?shù)鞍籽刂?xì)管內(nèi)一個(gè)堆積和分離基質(zhì)遷移時(shí),它們分離。分離后的蛋白固定到毛細(xì)管壁上。之后利用一抗鑒定目標(biāo)蛋白,用HRP結(jié)合的二抗和化學(xué)發(fā)光底物檢測蛋白。系統(tǒng)自動(dòng)報(bào)告檢測蛋白的分子量和信號(hào)。每次實(shí)驗(yàn)可同時(shí)分析**多12個(gè)樣品,結(jié)果可在3-5小時(shí)內(nèi)獲得。15-150 kDa的目標(biāo)蛋白均可檢測。軟件報(bào)告每個(gè)檢測蛋白的分子量、面積、面積百分比和信噪比。對于傳統(tǒng)的Western blot而言,結(jié)果的重復(fù)性一直是個(gè)挑戰(zhàn),因?yàn)槿狈?biāo)準(zhǔn)化的操作,且多個(gè)操作步驟引入了實(shí)驗(yàn)可變性。而Simple Western分析是完全自動(dòng)化的,因此結(jié)果的重復(fù)性更好。整體的定量也**改善了,因?yàn)槭∪チ宿D(zhuǎn)印步驟,從而避免了蛋白轉(zhuǎn)移的不一致。
轉(zhuǎn)膜(Transfer)
推薦在Western實(shí)驗(yàn)中選用PVDF膜。硝酸纖維素膜(NC膜)也可以使用,但硝酸纖維素膜比較脆,在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請參考生產(chǎn)商的推薦使用步驟。
通常如果使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置,可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA,轉(zhuǎn)膜時(shí)間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過夜。具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長,目的蛋白的分子量越小,需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。在轉(zhuǎn)膜過程中,特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時(shí),通常會(huì)有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象,比較好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。
轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn),通常分子量比較大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液(P0022)對膜進(jìn)行染色,以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液(P0017)對完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色,以觀察蛋白的殘留情況。
文章來源地址: http://m.cdcfah.com/cp/161934.html
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