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**初是sanger法,后來(lái)發(fā)展了幾種高通量測(cè)序方法1sanger法:雙脫氧測(cè)序的原理,DNA合成時(shí)加上一個(gè)ddNTP從而終止這條鏈的延伸,毛細(xì)管電泳讀取分析序列。一般教材講的都是這種方法,經(jīng)典,讀長(zhǎng)800bp,但是通量小成本高。2454:也稱焦磷酸測(cè)序,一個(gè)run下來(lái)約400M的數(shù)據(jù)量。將emulsionPCR產(chǎn)物連磁珠上,放入PicoTiterPlate,測(cè)序反應(yīng)是通過(guò)釋放PPi經(jīng)過(guò)ATP***化酶和熒光素酶作用發(fā)光D捕捉拍照,反應(yīng)是連續(xù)的,所以遇到連續(xù)的堿基如polyA時(shí),454易產(chǎn)生誤差。3Solexa:邊合成邊測(cè)序,將DNA單鏈固定在芯片上,合成DNA簇,是一種可逆阻斷的合成反應(yīng),浙江直銷RNA合成儀品牌企業(yè),浙江直銷RNA合成儀品牌企業(yè),每個(gè)循環(huán)只加上一個(gè)堿基、系統(tǒng)拍照一次。通過(guò)讀取拍照信號(hào)分析序列,一個(gè)run約200個(gè)G數(shù)據(jù)量以上,浙江直銷RNA合成儀品牌企業(yè)。目前能量比較高,不足是讀長(zhǎng)短,現(xiàn)在有PE150,可以測(cè)通300bp。4Soild:與454有相似之處,該方法更精細(xì),磁珠富集,磁珠更小,密度更高。它的獨(dú)特之處是連接反應(yīng)測(cè)序,加入8堿基熒光單鏈混合物。一次測(cè)序讀兩個(gè)堿基,獲得顏色編碼組成的堿基序列,通過(guò)幾輪反應(yīng)**終得出序列。5Iontorrent:特點(diǎn)是小巧。試劑通過(guò)集成的流體通路進(jìn)入芯片中,密布于芯片上的反應(yīng)孔立即成為上百萬(wàn)個(gè)微反應(yīng)體系。
13)如果分部收集器用來(lái)收集每個(gè)DMT脫保護(hù)步驟的流出物,確保試管充分清潔干凈,并打開(kāi)分部收集器,確保DMT廢液管路通向分部收集器。14)啟動(dòng)循環(huán),運(yùn)行開(kāi)始程序清洗試劑管路,除去原來(lái)的試劑。注意:TritylOnAuto表示在合成寡核苷酸的5’端核苷酸帶有一個(gè)DMT,并將其從固相載體上切下來(lái),儲(chǔ)存在收集瓶中;TritylOffAuto表示在合成寡核苷酸的5,端核苷酸沒(méi)有保護(hù)基團(tuán),將其從固相載體上切下來(lái),儲(chǔ)存在收集瓶中;TritylOnManual表示合成寡核苷酸的5’端核苷酸帶有一個(gè)DMT,寡核苷酸沒(méi)有從固相載體上切下來(lái),而是保留在合成柱中;TritylOffManual表示在合成寡核苷酸的5,端核苷酸沒(méi)有保護(hù)基團(tuán),寡核苷酸沒(méi)有從固相載體上切下來(lái),而是保留在合成柱中。DNA合成儀日常維護(hù)編輯1.瓶塞“O”形環(huán)一月檢查一次“O”形環(huán),**少1年更換1次。將新的備用“O”形環(huán)與儀器上的相比較,如果在“O”形環(huán)上出現(xiàn)白色沉淀,用棉花蘸取乙腈,進(jìn)行清洗。更換“O”形環(huán)的步驟如下:用止血鉗夾住“O”形環(huán),從槽中取下(或用牙簽鉤下),注意不要損壞托住“O”形環(huán)的白色聚氟乙烯插塞(tefloninsert);確保插塞上沒(méi)有顆粒后,用手指將新“O”形環(huán)推進(jìn)槽,進(jìn)行壓力實(shí)驗(yàn)。
DNA和RNA提取方法一、DNA的提取(方法一)1.實(shí)驗(yàn)試劑(1)DNA提取液:Tris HCl(pH),NaCl,EDTA,1%SDS(2)3MNaAc(3)TE:10mmol/LTris-HClmmol/LEDTA(4)酚():氯仿:異戊醇(25:24:1)(5)氯仿:異戊醇(24:1)(6)異丙醇(7)無(wú)水乙醇(8)75%乙醇(9)RNaseA2.實(shí)驗(yàn)步驟(1)取菌絲,在液氮中迅速研磨成粉(2)加入4mL提取液,快速振蕩混勻(3)加入等體積的4mL的氯仿:異戊醇(24:1),渦旋3~5min(此處是粗提沒(méi)有加酚,可以節(jié)約成本)(4)1000rpm,4℃,5min(5)上清用氯仿:異戊醇(24:1)再抽提一次(10,000rpm,4℃離心5min)(6)取上清,加入2/3倍體積的-20℃預(yù)冷異丙醇或,混勻,靜置約30min(7)用毛細(xì)玻棒挑出絮狀沉淀,用75%乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次,再用無(wú)水乙醇漂洗1次,吹干,重懸于500ulTE中(8)加入1ulRNaseA(10mg/mL),37℃處理1h(9)用酚():氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃離心5min)(10)取上清,1/10V3MNaAc,℃沉淀30min以上(11)沉淀用75%乙醇漂洗,風(fēng)干,溶于200ulTE中,-20℃保存?zhèn)溆枚?、DNA的提取(方法二)1.菌絲2.加入3mL65℃預(yù)熱的DNA提取緩沖液,快速振蕩混勻65℃水浴30min,期間混勻2-3次3.加入1mL5MKAc,冰浴20min4.氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃離心5min)5.取上清。
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