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**初是sanger法,后來發(fā)展了幾種高通量測(cè)序方法1sanger法:雙脫氧測(cè)序的原理,DNA合成時(shí)加上一個(gè)ddNTP從而終止這條鏈的延伸,毛細(xì)管電泳讀取分析序列。一般教材講的都是這種方法,經(jīng)典,讀長800bp,但是通量小成本高。2454:也稱焦磷酸測(cè)序,一個(gè)run下來約400M的數(shù)據(jù)量,上海新品RNA合成儀廠商。將emulsionPCR產(chǎn)物連磁珠上,放入PicoTiterPlate,測(cè)序反應(yīng)是通過釋放PPi經(jīng)過ATP***化酶和熒光素酶作用發(fā)光D捕捉拍照,反應(yīng)是連續(xù)的,所以遇到連續(xù)的堿基如polyA時(shí),454易產(chǎn)生誤差。3Solexa:邊合成邊測(cè)序,將DNA單鏈固定在芯片上,合成DNA簇,是一種可逆阻斷的合成反應(yīng),每個(gè)循環(huán)只加上一個(gè)堿基、系統(tǒng)拍照一次。通過讀取拍照信號(hào)分析序列,一個(gè)run約200個(gè)G數(shù)據(jù)量以上。目前能量比較高,不足是讀長短,現(xiàn)在有PE150,可以測(cè)通300bp。4Soild:與454有相似之處,該方法更精細(xì),上海新品RNA合成儀廠商,磁珠富集,磁珠更小,密度更高。它的獨(dú)特之處是連接反應(yīng)測(cè)序,加入8堿基熒光單鏈混合物。一次測(cè)序讀兩個(gè)堿基,獲得顏色編碼組成的堿基序列,通過幾輪反應(yīng)**終得出序列,上海新品RNA合成儀廠商。5Iontorrent:特點(diǎn)是小巧。試劑通過集成的流體通路進(jìn)入芯片中,密布于芯片上的反應(yīng)孔立即成為上百萬個(gè)微反應(yīng)體系。
給予指令。為了完成自動(dòng)合成,軟件應(yīng)用一個(gè)包含一系列步驟的循環(huán)來完成全部化學(xué)反應(yīng)。DNA合成儀操作步驟編輯以亞磷酰胺寡核苷酸合成為例介紹該類儀器的一般操作步驟。亞磷酰胺DNA合成的試劑有:保護(hù)堿基的5/—DMT,A、G、C、T亞磷酰胺單體,四唑偶聯(lián)催化劑,乙酐,N—甲基咪唑封閉試劑,三氯乙酸(TCA)脫保護(hù)溶液,12氧化混合物,乙腈清洗溶劑,氨水切除溶液。使用步驟如下:1)仔細(xì)檢查合成儀上所有試劑瓶中的試劑量,必要時(shí)換掉試劑瓶,特別注意乙腈的量,因?yàn)樵撊軇┯昧枯^大。2)將標(biāo)記好的清潔的收集瓶裝在合成儀上。3)將要合成的DNA序列輸入合成儀。4)檢查選擇的合成步驟是否正確。5)選擇結(jié)束方法:TritylOffAuto是儀器的原始狀態(tài),若打算以5,—DMT基團(tuán)連接純化寡核苷酸,將其轉(zhuǎn)變?yōu)門ritylOnAuto結(jié)束狀態(tài)。6)選擇結(jié)束方法,一般為系統(tǒng)的原始狀態(tài)。7)在每個(gè)柱監(jiān)視器的Use下,輸入你所希望的保存名字。8)以代碼代替相應(yīng)的DNA序列標(biāo)記每一個(gè)收集瓶。9)打印出每一個(gè)柱設(shè)置的詳細(xì)資料。10)檢查打印出來的資料是否正確。11)運(yùn)行StartColumn步驟檢查每一個(gè)柱的位置,確保合成儀上合成柱處于正確的位置。12)檢查連接在合成儀上的溶劑殘留(廢液瓶)是否充滿。
70%酒精2.實(shí)驗(yàn)步驟(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)(2)取約(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可!固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻(3)65℃水浴3-10min,期間混勻2-3次(4)加入等體積的酚(注意是酸酚):氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5min)(5)取上清,等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5min)(6)加入1/4V體積10MLiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)(7)10,000rpm,4℃離心20min(8)棄上清,用500ulSSTE溶解沉淀(9)酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提兩次,氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上(11)12,000rpm,4℃離心20min(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥(13)加200ul的DEPC處理水溶解(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))注意:提取RNA請(qǐng)盡量在低溫下操作,如果條件不容許。
文章來源地址: http://m.cdcfah.com/cp/104235.html
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